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高危型人乳头瘤病毒感染与肺癌的关系
 
 发布时间:2009-11-23     文章出处:中国实用医药2008年9月第3卷第26期 China PracMed, Sep 2008,Vol.
 

【摘要 】 目的  探讨豫北地区肺癌中高危型人乳头瘤病毒 ( H PV s) 感染情况及分型 ,为初步明确 H PV s感染与肺癌的关系提供依据。方法  收集新鲜肺癌标本 63 例 ,组织离体后分为两部分处理 : 一部 分用于 H E染色 ,以明确病变性质 ;另一部分用于提取基因组 DNA。采用聚合酶链反应 ( PCR )方法检测 肺癌组织中高危型 H PV s的感染情况及分型 ,并分析相关高危型 H PV s感染与肺癌组织学类型的关系。 结果  经病理检验证实 ,收集的 63例肺癌标本包括非小细胞肺癌 40 例 ,小细胞肺癌 23 例。在 63 例肺 癌中 , H PV 16 感染的阳性率为 68.25 % ( 43 / 63 ) ,其中 65.12 % ( 28 / 43 )为 H PV 16 单独感染 , 34.88 % ( 15 /43 )为 H PV 16 与 H PV 59 混合感染。H PV 59 感染的阳性率为 23.81 % ( 15 / 63 ) ,均为与 H PV 16 混合感染。 未检测到 H PV 18、31、33、58 和 52 感染的病例。在非小细胞肺癌和小细胞肺癌中 , H PV16 阳性率差异有 统计学意义 (χ2    = 6.977 , P < 0101 ) ,而 H PV 59阳性率差异无统计学意义 (χ2    = 0.086 , P > 0.05 ) 。结论  高危型 H PV s,特别是 H PV 16感染与肺癌存在密切的关系 ,且与其他类型 H PV s的混合感染值得重视。

【关键词 】 人乳头瘤病毒 ;肺癌 ;组织学类型

  根据致癌性的大小 ,人乳头瘤病毒 ( human papillom aviruses, H PV s)可分为低危型和高危型两大类型 ,前者如 H PV6 和11型等 ,主要引起尖锐湿疣等良性病变 ; 而后者如 H PV16、 18、31、33、52、58 和 59 型等 ,与感染细胞的恶性转化密切相 关 [ 1 ] 。越来越多的临床与流行病学资料显示 : 高危型 H PV s 感染在宫颈癌 [ 2 ] 、头颈部恶性肿瘤 [ 3 ] 、食管癌 [ 4 ] 、皮肤癌 [ 5 ]等 多种恶性肿瘤的发生和演进中起重要作用 。肺癌是常见的恶性肿瘤之一 ,其发病率和死亡率呈明显上升趋势 ,其与 H PV s 感染的关系国内外报道结果差异较大 [ 6~7 ] 。本研究采用聚合 酶链反应 ( polymerase chain reaction, PCR ) 方法检测豫北地区肺癌中高危型 H PV s的感染情况及分型 ,并分析相关高危型HPV s感染与肺癌组织学类型的关系 。为初步明确高危型H PV s感染与肺癌的关系提供依据 。

1  材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本收集  选取 2007 年 7 月至 2008 年 3 月在河南 第一荣康医院 、安阳市第一人民医院 、新乡医学院第三附属医 院住院并经手术切除的肺癌患者的新鲜标本 63 例 ,年龄 46~67岁 ,平均 ( 56.7 ±3.3 )岁 。组织离体后分为两部分 ,一部分用于提取基因组 DNA ,另一部分用 10%甲醛固定后备做病 理检验 。所有患者术前均未经放疗或化疗 。

1.1.2 主要试剂  100 bp DNA M a rke rs为美国 Invitrogen 公 司产品 。 dN TP s、Taq DNA 聚合酶 、DNA 提取试剂盒 (W izard SV Genom ic DNA Purifica tion System ) 等为美国 Promega 公司 产品 。RNA 酶 A、蛋白酶 K、琼脂糖等为德国 M e rk公司产品 。

1.1.3  PCR 引物  所有 PCR 引物均由上海生物工程公司合 成 。引物序列及目的片断长度见表 1。

表 1  引物序列及目的片段长度

引物名称                    序列 ( 5 ′23 ′)                                             片段大小 ( bp )

 H PV16 F            CA GA GTTTTGCACA GAACTGC                  457

H PV16R        CA TA TA TTCAA GCAA TGTA GGTGTA

H PV18 F            CACTACACTGCAA GA GA TA GA                 322

H PV18R            GTA GTGAAAACGTCGTTTTTGA

H PV31 F           GA TA TTGCA TGAACAAA GCTCG                 263

H PV31R            CA TA TTTACCTTTGTTTGTCAA

H PV59 F            CA TA GCGGAACTGCAA GAAA G                 215

H PV59R              TAAAACA GGGTA TCTGCA GC

H PV33 F            ACAA TACA GAACA TTGAACTA                  398

H PV33R             GTA TTTACACGTCACA GTGCA

H PV58 F             GTAAA GTCTGCTTACGA TTGC                  274

H PV58R             GTA GTTA GA GGTTACACTTGT

H PV52 F              TA TGGCTCCA GTGTGTGCA G                  229

 H PV52R    CTTA TA GTAA TTTCACTTAA TGGT                           

1.2 方法

1.2.1 肺癌组织的病理检验  常规 10%甲醛固定 、石蜡包 埋并切片后 ,进行苏木素-伊红 ( Hema toxylin2Eo sin, H E ) 染色 , 光学显微镜观察 ,以确定病变性质 。

1.2.2 基因组 DNA 的提取  按 P rom ega 公司试剂盒说明书 进行 ,过程如下 : 研碎组织后 ,移入 1.5 m l离心管中 ,加入消 化液并混匀 , 55℃温育 16 ~18 h。移消化完全的样品至小柱子中 ,13 000 r /m in,室温离心 3.5 m in。用 650μl洗液洗涤样品 3 次后 , 用 100 μl 无核酸酶的去离子水洗脱 DNA。测OD260 /280值并定量后于220℃保存备用 。

1.2.3  PCR 反应  取按 1.2.2 方法提取并定量的基因组DNA 为模板 , PCR 方法检测肺癌组织中高危型 H PV16、18、31、33、52、58和 59型等感染情况并分型 。引物及产物长度见表1。PCR 反应条件均为 : 94℃预变性 10 m in后接 94 ℃变性1 m in、55 ℃退火 1 m in和 72 ℃延伸 1 m in构成的 35 个循环 ,最后 72℃延伸 5 m in。产物以 15 g /L 琼脂糖凝胶电泳后观察 并照相 。

1.3 统计学方法  使用SPSS 11.5软件 ,计数资料采用 χ2 检验 ,检验水准 α = 0..05。

2  结果

2.1 病理检验结果  经H E 染色 ,病理诊断结果显示 : 收集 的 63 例肺癌标本包括非小细胞肺癌40 例 , 小细胞肺癌23例 。

2.2    肺癌中高危型 H PV s 感染情况及分型检测结果  按1.2.2 方法提取基因组 DNA 并定量后 , 按 1.2.3方法通过 PCR 反应 ,检测高危型 H PV16、18、31、33、52、58 和59 型的感 染情况 。结果显示 :在 63 例肺癌中 , H PV16 感染的阳性率为68.25% ( 43 /63 ) , 其中 65.12 % ( 28 /43 ) 为 H PV16 单独感染(图 1 ) , 34.88 % ( 15 /43 ) 为 H PV16 与 H PV59 混合感染 (图2 ) 。H PV59感染的阳性率为 23.81% ( 15 /63) ,均为与 H PV16混合感染 ,未见 H PV59 单独感染的病例 。未检测到 H PV18、31、33、58和 52感染的病例 (图 2 ) 。

图 1  H PV16 单独感染 PCR 检测结果M: 100  bp  DNA  M arkers;  1:  H PV16;  2:  H PV18;  3:  H PV31;  4: H PV59; 5: H PV33; 6: H PV58; 7: H PV52

 图 2  H PV16 合并 HPV59 感染 PCR 检测结果M: 100  bp  DNA  M arkers;  1:  HPV16;  2:  HPV18;  3:  HPV31;  4: HPV59; 5: HPV33; 6: HPV58; 7: H PV52213 高危型 H PV16 和 59 感染与肺癌组织学类型的关系 如表 2 所示 ,在非小细胞肺癌和小细胞肺癌中 , HPV16 阳性 率差异 有统计学意义(χ2    = 6.977 , P  = 0.008  < 0.01 ) , 而HPV59阳性率差异无统计学意义 (χ2    = 0.086 , P = 0.770 >0.05 ) 。


表 2  高危型 H PV16和 59感染与肺癌组织学类型的关系

类型                                 例数                  H PV16 阳性率 ( % )                                   H PV59 阳性率 ( % )

非小细胞肺癌                 40                            80100 ( 32 / 40 ) #                                   25100 ( 10 /40 ) 3
小细胞肺癌                     23                           47183 ( 11 / 23 )                                        21174 ( 5 / 23 )

注 : vs小细胞肺癌 , #χ2  = 6.977 , P = 0.008 < 0.01; vs小细胞肺癌 , 3 χ2  = 01086 , P = 0.770 > 0.05


3  讨论

  H PV s是一组双链闭环的小 DNA 病毒 ,约含 7800 ~8000 个碱基对 。H PV s基因组结构按其功能分为三个编码区 :早期 区 ( early region, E) 、晚期区 ( late region, L )和上游调节区 ( up-stream  regulatoryregion, URR ) 。早期区大约 4500  kb, 其中包含 8个早期开放读码框架 ( E1-E8 ) 。H PV s的早期基因是编 码病毒蛋白 、维持病毒复制和转录的基因 , 其中 E6 和 E7 基 因分别编码含 158个氨基酸和 98 个氨基酸的 E6 和 E7 癌蛋 白 ,两者均存在 Cys-X-X-Cys (色氨酸 -X-X-色氨酸 )模体 ,具有 锌指结构域 ( zinc-binding structure ) , 它们能破坏细胞周期的 调控机制 ,诱导细胞进入 S期 ,从而使感染 H PV s并表达 E6 和 E7癌蛋白的细胞绕过正常细胞周期检测点 , 最终发生细胞永生化 [ 8 ] ; E6和 E7癌蛋白在转化细胞中的持续表达 ,是细 胞转化和转化组织恶性表型维持的关键 [ 9 ] 。晚期区约 2500 bp ,含 L1 和 L 2 基因 ,分别编码主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋 白 ,组装成 H PV s的衣壳 。URR 区位于 L 1 基因终止码和 E6 基因之间的区域 ,长约 400 bp ,含有多个结合位点 ,通过转录 因子的相互作用 ,控制 H PV s病毒复制和基因表达 。


  目前世界上已发现 H PV s亚型达 100余种 ,随着 H PV s型 别的不断被发现 ,人们逐渐认识到某些特定 H PV s型别与某 种疾病或人体某个特定部位的病变以及病变性质有关 ,而且同疾病可以由某一种 H PV s型别或多种 H PV s型别引起 ,某 一种 H PV s型别也可引起不同疾病 。在 H PV s导致的良恶性病变中 ,最常见的是皮肤和肛门生殖器部位病变 。全世界5.5%的现患癌症与高危型 H PV s有关 [ 10 ] 。


  本研究通过对 63 例肺癌组织新鲜标本中高危型 H PV s DNA 进行检测及分型后 ,发现所有标本中 H PV16感染阳性率 为 68.25% ( 43 /63) ,为最常见的感染类型 ; H PV59 感染的阳性率为 23181 % ( 15 /63 ) ,仅次于 H PV16;但未检测到 H PV18、31、33、58 和 52 感染的病例 。C lave l 等 [ 11 ] 研究显示 : 与支气 管肺癌相关的 H PV s包括 H PV16、18、31、33 和 35 等 。Ch iou 等 [ 6 ]研究显示 :在我国台湾地区 H PV16 和 H PV18 型感染者 患肺癌的风险明显增加 。上述资料不仅说明肺癌与高危型 H PV s感染密切相关 ,而且提示不同地区肺癌中感染 H PV s的 亚型有所不同 ,在豫北地区与肺癌相关的 H PV s型别可能以 H PV16和 59型为主 。因此 ,研究不同地区肺癌患者 H PV s感 染的型别是十分必要的 。值得注意的是 , W e lt等 [ 7 ]检测了32例肺鳞癌和 6 例小细胞肺癌组织的 H PV s感染情况 ,结果发现没有 1 例感染 H PV s,由此认为常见的 H PV s型别在支气管 癌发病机制中没有发挥重要作用 。因此 , 关于高危型 H PV s 感染与肺癌的关系需要进一步的深入研究 。

  另外 ,本研究的结果还显示 : 在 43 例 HPV16 阳性的肺癌 中 , 65.12% ( 28 /43 ) 为 HPV16 单独感染 , 34.88% ( 15 /43 ) 为 HPV16与 HPV59混合感染 ; 15 例 HPV59 阳性的肺癌中 ,均为 与 HPV16混合感染 ,未见 HPV59单独感染的病例。因此 ,在肺癌与高危型 HPV s的关系中 ,高危型 HPV s的混合感染是值得重视的。本研究进一步分析了非小细胞肺癌和小细胞肺癌中 HPV16和 HPV59感染的差异 ,结果显示 : HPV16阳性率差异有 统计学意义 ,而 HPV59 阳性率差异无统计学意义。这可能是 与 HPV59感染阳性率较低有关 , 需要扩大样本量进行深入 研究。

  综上所 述 , 本 研 究 初 步 证 明 了 高 危 型 H PV s, 特 别 是H PV16感染与肺癌存在密切的关系 ,且与其他类型 H PV s的 混合感染值得重视 。从而为阐明肺癌的病因提供了实验依据 ,为设计以高危型 H PV16为靶点的肺癌治疗方案奠定了初步基础 。

参  考  文  献
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